生物指示劑（BIs）作為評估滅菌效果的關(guān)鍵工具，其最短培養(yǎng)時間（MIT）的測定長期面臨缺乏國-際-公-認方法的困境。1986年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）雖試圖在設(shè)備和放射健康中心（CDRH）通過發(fā)布《生物指示劑培養(yǎng)時間驗證指南》提出了將縮短培養(yǎng)時間（RIT）至七天以下的方法，但由于缺乏實證支持，該方法未能得到廣泛應用。為解決這一行業(yè)難題，2007年，國際標準化組織/技術(shù)委員會198（ISO/TC198）生物指示劑工作組啟動技術(shù)規(guī)范制定計劃，明確要求所制定的方法需通過同行評審驗證。

在此背景下，美國醫(yī)療器械促進協(xié)會于2008年成立特設(shè)委員會展開專項研究，其發(fā)表的兩項成果為MIT測定奠定了理論基礎(chǔ)。本文將詳細闡述基于這些成果提出的創(chuàng)新MIT測定方法。

一、最短培養(yǎng)時間（MIT）測定方法

本研究深入分析了10,000多種暴露于不同滅菌過程的生物指示劑的生長時間，研究范圍涵蓋多種生物指示劑配置，包括自含式生物指示劑和傳統(tǒng)孢子條，孢子載體選用紙和不銹鋼材質(zhì)。同時，選取嗜熱土芽孢桿菌和萎-縮芽孢桿菌這兩種最-常-用的細菌內(nèi)孢子作為研究對象。

科德角國際丨BI-O.K.™ 蒸汽滅菌自含式生物指示劑（左）

BI-O.K.™ 環(huán)氧乙烷自含式滅菌生物指示劑（右）

在實驗過程中，嚴格控制生長培養(yǎng)基，并選擇121℃、132℃、134℃和135℃的濕熱滅菌，以及環(huán)氧乙烷（EO）氣體、過氧化氫（H2O2）蒸汽和二氧化氯（ClO2）氣體等多種滅菌工藝。這些滅菌工藝不僅是常用的滅菌手段，還具有不同的致死機制，如H2O2介導的能量轉(zhuǎn)移、烷基化和氧化等，從而確保了研究的全面性和代表性。

研究對不同組別的生物指示劑在以下三種條件下進行評估：

1、未暴露：作為對照組。

2、暴露于各種滅菌過程：使30%-80%的生物指示劑檢測結(jié)果為非無菌（即生長呈陽性）。在此條件下，部分生物指示劑無菌，部分非無菌，符合FDA CDRH協(xié)議的要求。

3、根據(jù)特定公式計算的時間暴露：

依據(jù)ISO11138-1、ISO14161和美國藥典中公布的計算存活時間（CST）公式確定暴露時間。

所有暴露后的細菌培養(yǎng)物均進行培養(yǎng)，直至觀察到非無菌結(jié)果，或最長培養(yǎng)7天，通過培養(yǎng)基渾濁、pH指示劑顏色變化等證據(jù)判斷非無菌結(jié)果。

二、關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：揭示生物指示劑生長規(guī)律

通過生長時間研究，獲得了一系列與確定最短培養(yǎng)時間（MIT）密切相關(guān)的重要發(fā)現(xiàn)：

1、無論滅菌過程類型、致死機制以及生物指示劑上的孢子種類如何，生物指示劑生長時間范圍近似正態(tài)分布。

2、暴露后的生物指示劑上存活孢子的數(shù)量與觀察到的生長時間呈反比。即存活孢子數(shù)量較多的生物指示劑，其生長時間相對較短；反之，存活孢子數(shù)量較少的生物指示劑，生長時間則較長。

3、約1.1%的生物指示出現(xiàn)生長時間延長現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在所有研究的滅菌過程中均有發(fā)生，且僅在滅菌暴露產(chǎn)生實驗區(qū)結(jié)果時才會發(fā)生。

4、在CST條件下暴露的生物指示劑無生長時間延長情況，且生長時間更快更穩(wěn)定。

三、舊方法局限：FDA CDRH協(xié)議的爭議

FDA CDRH協(xié)議難以被廣泛接受，主要原因在于缺乏測試結(jié)果來支持該方法及其接受標準。該協(xié)議要求進行三次滅菌暴露，每次使用100個生物指示劑，且需保證30%-80%的生物指示劑測試結(jié)果為非無菌；同時還規(guī)定縮短培養(yǎng)時間（RIT）與7天培養(yǎng)時間結(jié)果的相關(guān)性必須大于97%。然而，批評者認為，30%-80%的數(shù)值設(shè)定及相關(guān)性要求缺乏合理依據(jù)，國際社會普遍質(zhì)疑其選擇標準的科學性，但始終未有相關(guān)原理或測試結(jié)果能夠?qū)Υ诉M行證明。

從微生物暴露于滅菌過程的效應來看，在僅有兩種可能結(jié)果（無菌或非無菌）的實驗條件下，部分生物指示劑可能僅有一個孢子存活，其他生物指示劑存活孢子數(shù)量較少。僅有一個孢子存活的生物指示劑，其孢子可能未受嚴重損壞或受到嚴重影響，這會導致生長時間的顯著差異。

根據(jù)泊松分布預測，當滅菌暴露使50%的生物指示劑為非無菌時，約35個生物指示劑僅有一個孢子存活，其余15個有兩個及以上孢子存活，且僅有一個存活孢子的生物指示劑生長時間大多處于較窄范圍，少數(shù)會出現(xiàn)生長時間延長。例如在濕熱和環(huán)氧乙烷滅菌過程中，分別僅有2/458（0.44%）和3/309（0.97%）個生物指示劑出現(xiàn)生長時間延長的情況。

當暴露條件導致的無菌比例較低時（如35%與75%相比），更易出現(xiàn)生長時間較長的生物指示劑。以35%的非無菌結(jié)果為例，每個暴露的生物指示劑平均存活孢子數(shù)為0.43，而75%非無菌結(jié)果時平均存活孢子數(shù)為1.39。隨著非無菌生物指示劑百分比降低，按比例來說，更多無菌生物指示劑將僅有一個有活力的孢子。因此采用CST計算所規(guī)定的暴露時間內(nèi)處理生物指示劑，使存活孢子數(shù)量保持在較低水平，是開發(fā)可行MIT方法的重要前提。

四、新方法：基于CST的MIT測定方案

基于先前研究測試結(jié)果及數(shù)據(jù)分析，現(xiàn)提出確定生物指示劑最短培養(yǎng)時間（MIT）的新方法：

1、從三個批次中分別獲取至少100個由不同孢子作物生產(chǎn)的生物指示劑。

2、測定每個批次生物指示劑的D10值和孢子數(shù)量。

3、運用公式計算每批生物指示劑的存活時間（公式：CST=D10值×[log10初始孢子數(shù)-2]，單位：分鐘），該公式旨在使100%的生物指示劑檢測結(jié)果為非無菌。

4、在CST條件下，通過單獨的電阻計運行對每批生物指示劑進行暴露處理。

5、采用生物指示劑制造商指-定的回收方法（或指-定的生長培養(yǎng)基），并在規(guī)定的環(huán)境條件下操作。

6、持續(xù)培養(yǎng)，直至所有生物指示劑均檢測出非無菌結(jié)果，或培養(yǎng)時間達到7天（若7天后仍未檢測出非無菌，則需重新確認D10值和孢子總數(shù)）。

7、記錄所有生物指示劑的非無菌測試時間。

8、MIT為三個生物指示劑批次中出現(xiàn)非無菌結(jié)果的最長時間。

在確定CST時，建議使用Holcomb-Spearman-Karber（微生物破壞定量檢測數(shù)據(jù)分析方法）方法計算D10值。該方法利用一系列滅菌暴露中的所有分數(shù)陰性結(jié)果，計算“平均無菌時間"和相關(guān)的D10值。從統(tǒng)計學角度來看，這種方法計算出的D10值更有可能是最準確的，能夠提供最佳的D10值估計。

五、新方法：契合現(xiàn)代滅菌監(jiān)測需求

開發(fā)新的MIT測定方法需充分考慮滅菌過程監(jiān)測和控制方法的發(fā)展。早期濕熱滅菌器監(jiān)測手段有限，生物指示劑測試結(jié)果對確定滅菌工藝有效性至關(guān)重要。而如今，滅菌過程在工藝驗證框架下進行，現(xiàn)代滅菌器配備先進監(jiān)測和控制系統(tǒng)，生物指示劑檢測結(jié)果從屬于記錄的物理/化學結(jié)果，即便生物指示劑全部滅活，若物理/化學要求不滿足，滅菌過程仍判定為不合格。

大量實驗表明，未暴露與經(jīng)過滅菌處理的生物指示劑孢子萌發(fā)和生長動力學存在差異，未暴露的生長速度快、時間變化小，經(jīng)過滅菌處理的平均生長時間長、變化大。新提出的使用CST滅菌暴露的MIT方法，充分考慮了這種變異性，避免了“異常"結(jié)果的不當影響。相比之下，F(xiàn)DA CDRH方案中30-80%的存活率窗口存在問題，其縮短培養(yǎng)時間（RIT）的結(jié)果常受僅有單個孢子存活的生物指示劑異常結(jié)果主導，缺乏穩(wěn)健性和可重復性。

預計本文提出的MIT方法不會降低生物指示劑在監(jiān)測和控制滅菌過程中的有效性，反而能提供可重復確定生物指示劑生長時間的可靠方法為生物指示劑在現(xiàn)代滅菌監(jiān)測中的應用提供更科學、準確的技術(shù)支持。